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CRISPR/Cas9, la chirurgie de l’ADN9 minutes de lecture

C

CRISPR/Cas9 ? Ces acronymes ne vous disent certainement rien, et pourtant c’est bel et bien l’avenir de la biologie, et ce n’est pas une hyperbole. Cet article est, je l’espère, le début d’une longue série d’articles un peu plus poussés sur cette technique de biologie génétique.

Cependant, il s’agit d’un sujet complexe et c’est d’ailleurs pour cela que cet article servira de base afin que vous compreniez globalement le principe de CRISPR/Cas9.

Alors, CRISPR/Cas9, c’est quoi ? 

C’est en réalité un système de défense immunitaire chez les bactéries (50 à 60% des bactéries) et les archées (90%) (« [ce] sont des microorganismes unicellulaires procaryotes, c’est-à-dire des êtres vivants constitués d’une cellule unique qui ne comprend ni noyau ni organites, à l’instar des bactéries.« , Wikipédia). Il est composé de ce qu’on appelle « CRISPR » pour « clustered regularly interspaced short palindromic repeats » et de plusieurs gênes formant un opéron (groupe de gênes répondant à un même signal) appelé Cas operon. Cet opéron va notamment être responsable de la sécrétion des protéines Cas qui seront développées un peu plus loin dans l’article.

Ce système permet aux organismes qui en sont dotés de lutter contre des virus (ou « phages« ) qui les infectent. Grâce à CRISPR/Cas, l’ADN du virus est lu, reconnu puis découpé pour être rendu inactif.

Voilà, maintenant que vous savez à peut prêt ce qu’est CRISPR/Cas, passons aux choses sérieuses.

Fonctionnement du système Crispr/Cas

Premièrement, il convient de préciser qu’il existe de nombreux système CRISPR/Cas dans la nature. Voici un bref exemple des systèmes que l’on retrouve :

Classification des systèmes Crispr/Cas

Ici, nous allons uniquement nous intéresser au type II car il s’avère être le système le plus simple : Cas9 s’occupe de presque tout. Alors, comment ce système fonctionne-t-il ? 

Chez tous les êtres vivants, une analyse de l’ADN révèle des morceaux d’ADN de virus et c’est le cas tout particulièrement chez les bactéries et les archées. Chez ces organismes, cela leur permet de pouvoir se défendre.

En effet, lorsqu’un phage infecte la bactérie, elle est sensée mourir mais il arrive que cette infection soit dite « abortive », c’est-à-dire que l’infection ne provoque pas la mort de celle-ci. Les enzymes de l’adaptation (principalement Cas1 et Cas2 chez le type 2) récupèrent cet ADN et vont l’inclure dans une sorte de base de donnée génétique (donc héréditaire) : un CRISPR-array.

Chaque morceau d’ADN de virus (morceaux appelés « spacers« ) est séparé par des moreaux de code toujours identiques et qui peuvent être palindromiques (ndlr : code qui peut se lire de droite à gauche comme de gauche a droite. Ce n’est pas le cas pour CRISPR/Cas9). [1. Conférence « The CRISPR-Cas9 revolution genome engineering: lessons learned from bacteria » par Emmanuelle CHARPENTIER][2. Conférence « Genome Engineering and the Future of Human Health » par Jennifer DOUDNA][3. Amitai G, Sorek R. 2016. CRISPR-Cas adaptation: insights into the mechanism of action. Nat. Rev. Microbiol. 14(2):67–76]. Pour rendre cela plus simple, il est possible de comparer ce CRISPR-array à un télégramme qui serait donc codé comme ceci dans l’ADN :

Virus1. Stop. Virus2. Stop. Virus3. Stop.

Plus tard, si un même phage se retrouve à infecter cette bactérie ou sa descendance, des enzymes de l’interférence (Cas9 chez le type 2) vont venir lire l’ADN du phage, et si il correspond à une partie de la base de donnée constituée par CRISPR, elle le découpe et le rend inactif[4. Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, et al. 2007. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 315(5819):1709–12][5. Makarova KS, Grishin NV, Shabalina SA, Wolf YI, Koonin EV. 2006. A putative RNA-interferencebased immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol. Direct 1:7]. Bien évidemment, il s’agit ici d’un raccourci pour ne pas rendre ça trop indigeste.

Plus de détails sont disponibles ci-dessous mais si vous êtes déjà perdus, je peux vous dispenser de lecture. Âmes sensibles s’abstenir ;).

Explications avancées

Bon, maintenant que vous êtes là, passons aux choses sérieuses. Au bout de la séquence CRISPR-array se trouve une séquence appelée « Leader Sequence« . C’est une région promotrice qui permet de transcrire cet array en molécules d’ARN.

Intervient l’étape de l’expression de l’ARN : les séquences phagiques ou plasmiques vont être exprimées en une longue séquence d’ARN appelée pre-crRNA. Cette dernière va être reconnue par une protéine Cas synthétisée par l’opéron : une endoribonucléase.

Cette RNase va alors reconnaître chaque répétitions « inter-spacers« , cliver l’ARN au niveau de chaque répétitions pour produire des petits fragments d’ARN (crRNA) qui iront s’associer à une protéine Cas (endonucléase Cas9). Ce complexe Cas va ensuite « parcourir » l’ADN du phage jusqu’à ce que le fragment d’ARN se lie à son ADN par complémentarité de base.

L’enzyme produit alors une cassure double brin (des deux brins d’ADN) via le HNH Nuclease Domain (cyan sur l’image) et le RuvC Nuclease Domain (gris sur l’image).

Modélisation de l'endonucléase Cas9
Endonucléase Cas9

Pour que le clivage ait lieu, il faut en plus de crRNA un autre ARN, le tracrRNA. Les laboratoires de Jennifer DOUDNA et d’Emmanuelle CHARPENTIER ont travaillé conjointement afin de combiner ces deux ARN en un seul : sgRNA (single guide RNA). L’opération ne nécessite maintenant plus qu’un seul ARN au lieu de deux.

L’ADN du virus est neutralisé.

Clivage de l'ADN par le complexe Cas9

L’intérêt de CRISPR/Cas9

Comme nous avons pu le voir précédemment, le système Crispr/Cas9 fait office de scalpel biologique. Il existait déjà d’autres techniques avec cette spécificité comme les « Nucléases à doigts de Zinc » (ou Zinc Finger Nucleases, c’est plus stylé) ou encore les TALENs.

Les nucléases à doigts de zinc sont des enzymes de restriction artificielles créées par la fusion d’un domaine de liaison à l’ADN, de type « doigt de zinc », et d’un domaine catalytique de coupure de l’ADN (nucléase).

Décrits pour la première fois en 2009, les Transcription activator-like effector nucleases (TALENs, nucléases effectrices de type activateur de transcription) sont des enzymes de restriction artificielles générées par fusion d’un domaine de liaison à l’ADN, appelé TALE, avec un domaine ayant la capacité de cliver l’ADN.

Bien qu’il existe d’autres méthode, CRISPR/Cas9 présente de nombreux avantages. Avec les ZFNs et TALENs, les protéines étaient spécifiques : en plus d’être coûteuses elles étaient synthétisées de A à Z uniquement pour découper un bout bien précis d’ADN, rien de plus. Ici, le complexe n’est qu’à programmer, il suffit de fournir le bon ARN et Cas9 se charge de tout.

Un autre avantage : le multiplexing. Il est possible de réaliser de multiples opérations simultanément pour un moindre coût.

Au niveau de la biologie génétique, quel est vraiment l’intérêt de CRISPR/Cas9 ?

Tout simplement, en fournissant n’importe quel ARN Cas9 ira le découper peu importe la cellule cible. On peut techniquement couper l’ADN de n’importe quel organisme !

Cela va encore plus loin. Lorsqu’un organisme subit une cassure double brin de son ADN intervient alors la recombinaison homologue[6. Jörg Renkawitz, Claudio A. Lademann et Stefan Jentsch, « Mechanisms and principles of homology search during recombination », Nature Reviews. Molecular Cell Biology, vol. 15, no 6,‎ , p. 369–383]. 

Cette recombinaison intervient en 3 étapes :

  • Une phase pré-synaptique, le site ayant subi cette cassure double brin est reconnu,
  • Une phase synaptique, l’organisme cherche dans le milieu un morceau d’ADN similaire (homologue) intact pour réparer la liaison,
  • Une phase post-synaptique,synthèse d’ADN et résolution de la cassure. L’ADN est restauré.

C’est au court de la phase synaptique de la recombinaison homologue qu’opère la magie : si vous provoquez une cassure double brin puis incorporez dans le milieu de l’ADN similaire, vous venez d’effectuez votre première greffe d’ADN.

En plus de cela, il est possible de modifier Cas9 pour non pas casser l’ADN mais inhiber ou favoriser la transcription d’un gêne[7. Vijai Singh, et al., Exploring the potential of genome editing CRISPR-Cas9 technology, 2016]. Pour cela, deux mutations ont dû être effectuées, l’une sur le domaine Ruv-C (D10A) et l’autre sur le site HNH (H840A). Tous les deux permettent de couper un brin d’ADN.

Cette version mutée de Cas9 est connue sous le nom de « dead » Cas9 (ou dCas9). Elle reste active en se liant a l’ADN mais ne peut désormais plus le couper[8. Bikard et al., 2013; Qi et al., 2013]. Cette modification du système CRISPR/Cas9 s’appelle CRISPR-Interference (ou CRISPRi) et peut donc interférer avec l’expression des gênes.

Applications

Concrètement, CRISPR/Cas9 c’est la porte ouverte à tous les films de science fiction. Puisqu’il est possible de couper l’ADN, moduler son expression, remplacer et ajouter des gênes, techniquement tout est possible. Vous pouvez prendre une le gêne d’une méduse produisant de la GFP (Green Fluorescente Protein), l’implanter dans votre chat et ainsi obtenir un chat qui brille dans le noir, ça a de la gueule non ? 

Les scientifiques espèrent même d’ici quelques années ressusciter les mammouths, oui, vous avez bien lu[9. http://www.futura-sciences.com/planete/actualites/zoologie-ils-veulent-ressusciter-mammouth-ici-2-ans-66358/].

Plus sérieusement, puisque les techniques permettent non seulement d’appliquer CRISPR/Cas chez des êtres vivants adultes, il serait possible de guérir les maladies génétiques comme la mucoviscidose, l’hémophilie, la drépanocytose, etc…

Il est aussi possible de guérir les cancers en corrigeant les mutations des cellules tumorales.

Cependant, c’est aussi la porte ouverte à l’Eugénisme. Puisqu’il est possible pour un moindre coût de modifier génétiquement un être vivant, pourquoi ne pas rendre son enfant plus grand, plus fort, plus intelligent, plus résistant aux maladies ?

Autrement, il est aussi possible de se servir de CRISPR/Cas comme arme de guerre. Une inoculation pourrait très bien vous tuer en désactivant des fonctions vitales, en causant des mutations, etc… C’est d’ailleurs un sujet qui inquiète les services secrets, notamment américains[10. https://motherboard.vice.com/en_us/article/obamas-science-advisors-are-worried-about-future-crispr-terrorism].

Conclusion

CRISPR/Cas9 s’avère être une véritable révolution, notamment pour la santé humaine. Cependant, il peut aussi s’avérer très dangereux par exemple à cause du terrorisme et soulève grandement la question de l’éthique. Quelles sont les limites à ne pas franchir ? Un consensus éthique international s’impose, mais honnêtement je ne vois pas ce qui empêcherait certains pays de ne pas en tenir compte…

De plus, je n’ai pas parlé des « off-targets« , les dommages collatéraux. Une enzyme n’est pas infaillible : elle pourrait très bien couper par erreur (même si le risque est faible et que des travaux sont en cours pour limiter les risques) un morceau d’ADN, et donc provoquer potentiellement la mort de l’individu.

Alors, que pensez-vous de cette nouvelle technologie ?

A propos de l'auteur

Clément POIRET

Créateur et rédacteur du site Science Exploits, je suis aussi passionné de science et de sport. Je pratique très régulièrement de la gymnastique et du street workout/calisthenics. Je suis ici pour combiner ma passion pour les sciences et mon envie de partager ce que je trouve de plus intéressant parmi les nombreuses études scientifiques.

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